Northern Blot

 

1. Make up of agarose gel

    agarose                             0.96 g (1.2%)

    D.W(autoclaved 0.1% DEPC)        58.8 ㎖

    → boiling and cooling until 60 ℃

 

2. Add followings and mix up  

    10x MOPS running buffer            8 ㎖ (1x)

    Formaldehyde                       13.2 ㎖ (16.5%)

      

3. Cast and clean up the running tank

4. Fill the running tank with 1x MOPS buffer

5. Mix each RNA sample with loading buffer (FFM)

    → sample : FFM = 1 : 3

    → loading하기 전에 RNA는 반드시 정량을 실시해야한다.

    → gel에 따라서 loading volume이 달라질 수 있으나 가급적 30㎕를 넘지 않도록 한다.

6. Denature the sample at 65℃ for 10 min

7. Quickly on ice for 5min

8. Spin down and loading

   → loading 하기 전에 comb에 남아있는 찌꺼기를 pipetting으로 제거하고

      prerunning을 10min실시

9. Run the gel at a constant voltage of ~5 V/cm : 80V, 1hr 20min.

10. After running, take a photography

11. Transfer on the nylone membrane with capillary method

                                   

                                                          heavy material (book)

                                          

                                                          휴지  

                                                         3MM paper

                                                         Nylone membrane

                                                         gel

                                                         3MM paper

                                                         bridge and 10 x SSC or SSPE

                

  

   1) 3MM paper위에 gel을 놓기 전에 gel놓는 부분 외의 곳으로 물이 흡수되는 것을 방지하기        위해 parafilm으로 gel 놓는 곳 외의 부분은 막는다(차단한다).

   2) Nylone membrane은 gel보다 조금 크게 만든다.

   3) Nylone membrane위에 놓는 3MM paper는 Nylone membrane보다 조금 크게 만든다.

   4) Gel을 올려놓을 때는 뒤집어서 밑부분이 위로 오도록 한다.

   5) Gel을 올려놓을 때는 gel의 필요 없는 부분을 자르는데 이 때 lane에 너무 근접해서

      자르면 안되고 어느 정도 여유 분을 두고 자른다.

   6) Nylone membrane은 DEPC D.W에 먼저 5min activation시킨 후 10 x SSC or SSPE에          10min activation시킨 후 사용한다. 그리고 오른쪽 윗면을 조금 잘라서 방향성을 표시한다.

   7) 10 x SSC or SSPE는 bridge가 반정도 잠길 정도로 부어준다.

   8) Transfer 소요시간 : 16-20hr

   9) RNA transfer가 잘 되지 않는 경우는 gel을 NaOH와 NaCl를 각각 0.4N, 1M이 되게 첨가       한 10x SSPE에 5분 정도 담가두었다가 transfer를 하면 거의 대부분이 transfer된다.

 

 12. Cross link the membrane using baking (80℃ for 2 h) or UV cross linker (120 J)

 

    1) Cross linking하기 전에 membrane을 10 x SSC or SSPE로  washing해서 salt를 제거시         켜준다.

    2) 0.1% DEPC D.W에 적신 3MM paper위에 membrane를 놓고 UV cross linking실시.

       → gel과 맞닿았던 면(앞면)은 두 번 실시 반대면(뒷면)은 한번 실시

    3) 0.1% DEPC D.W로 membrane을 washing한 후 3MM paper위에서 membrane을 말린다.

    4) Membrane이 마르면 membrane의 앞면에 28S, 18S위치를 볼펜으로 표시하고, 제일 윗면        또는 아랫면(RNA가 없는 여백부분)에 RNA의 이름을 labelling한다.

 

 13. Prehybridization at 42℃ for 2 hr with prehybridization buffer

 

    ※ Prehybridization buffer (20 ml)

    

      10% SDS                                 300㎕

      20x SSPE                                5 ml

      100x Denhardts solution                   1  ml

      Salmon sperm DNA (10mg/ml)            300㎕

      100 % formamide                         10 ml

      0.1% DEPC-treated D.W.                  3.4 ml

  ---------------------------------------------------  

      Final                                     20 ml

 

     ☞ Salmon sperm DNA (10mg/ml)는 100℃ 10min간 denaturation시킨 후 사용한다.

     ☞ Salmon sperm DNA (10mg/ml)는 non-specific reaction을 blocking 해주는

        효과가 있다. (probe가 non-specific하게 binding하는 것을 방지)

     ☞ SDS는 salt (SSPE)를 놓어주기전에 넣어주어야 한다. salt를 먼저놓고 SDS를 넣으면 침          전물이 생긴다.

    1) Hybridization bag에 membrane을 앞쪽(RNA가 binding된 쪽)이 buffer에 노출되도록

      넣는다.

    2) Hybridization bag안에 기포가 안 생기도록 기포를 모두 뺀 다음 levero로 밀봉한다.

       →밀봉할 때 membrane에 너무 가까이 밀봉하지 말고 가급적 윗부분을 밀봉한다.

         (∵hybridization할 때 다시 밀봉)

    3) 42℃, compact rocker로 2hr이상 hybridization실시 (O.N도 무방)

 

   

 14. Probe preparation (choose one of followings)

   

    (1). Random priming with klenow fragment (exo-free)

        

        ① DNA template(insert region)                          x ul (20 - 200 ng)

        ② Klenow (4 U/ul)                                     1 ul

        ③ 10 x reaction buffer                                  2 ul

        ④ BSA (10mg/ml)                                      2 ul

        ⑤ dNTP mix (0.5 mM each, except dCTP)              3 ul

        ⑥ [α-32P]dCTP                                         5 ul (50 uCi)

        ⑦ Random hexamer (0.5ug/ul)                           1 ul

        ⑧ D.W.                                                y ul

           final                                                 20 ul

     

      1). Mix DNA template and D.W.

      2). Boiling 10 min.

      3). Chill on ice for 5 min and spin down

      4). Add ②-⑦ and mix well

      5). Incubate at 37 ℃ for 2 hr

      6). Add 0.5mM EDTA 1ul for reaction stop(inactivation of Klenow)

      7). Add DEPC D.W (0.1%) final 200㎕

      8). Saphadex G-50 spin column

 

        ※ Saphadex G-50 spin column 사용법

        

         ① Invert column several times to fully resuspend the gel

         ② Remove top closure and bottom closure, and allow the buffer to drain from the               column → 이 때 air가 들어가서는 안 된다.

         ③ Column을 collection tube에 넣고 1,100xg에서 1분간 원심 분리한다.

         ④ Collection tube속의 buffer를 모두 버리고 다시 TE or D.W 200㎕를 넣고 1,100xg에              서 1분간 원심 분리한다.

         ⑤ Place the column in a new collection tube and apply 200㎕ sample to column

         ⑥ 1,100xg, 4min centrifugation.

         ⑦ The labelled nucleic acid will be recovered in the collection tube.

      

        ※ Nick column 사용법

         

         ① Remove top closure

         ② Remove bottom closure

         ③ Allow the buffer to drain from th column

         ④ Fill in column with 2ml SET〔0.1%SDS, 1mM EDTA(pH 8.0),

            10mM Tris·cl(pH 8.0)〕or TE(pH 8.0)

         ⑤ Allow the buffer to drain from th column

         ⑥ Pour 200㎕ of labelled solution into column

         ⑦ Recover the labelled solution with collection tube

         ⑧ Pour 200㎕ of SET buffer or TE(pH 8.0) into column

         ⑨ Recover the labelled solution with collection tube

         ⑩ Repeat ⑧-⑨ until serial number ＃10

         ⑪ Measure the radioactivity

           → Saphadex column은 큰 size가 먼저 나오고 작은 size가 나중에 나온다.

           → Serial collection tube의 radioactivity를 graph로 그리면 2개의 peak가 나온다. 이                중에서 첫 번째 것이 full length labelled probe이고 두 번째 것이 unlabelled                     isotope이거나 short length labelled probe다.

 

       9) Boiling, 10min

        →이 단계는 dsDNA를 ssDNA로 만들어주는 과정이다.

      10) Immediately on ice 5min. (Quick step)

 

    (2). PCR reaction

      1). PCR reaction with specific primer,  [α-32P]dCTP and cDNA template

      2). agarose gel running

      3). extraction the probe from agarose gel

   

    (3). Nick translation

       

    (4). In vitro transcription

 

 

15. Hybridization at 42 ℃ for O.N

    

    1) Prehybridization bag의 한쪽 귀퉁이를 조금 짜른다.

    2) Yellow tip을 꽂아 약간의 틈을 만든 뒤 그 틈 사이로 probe(200㎕)를 앞면 쪽으로

       넣는다.

    3) 자른 귀퉁이를 종이로 감싼 후 bag을 inverting해서 probe가 섞이게 한다.

    4) Hybridization bag내부의 기포를 없앤 후 levero로 밀봉한다.

    5) Hybridization at 42 ℃ for overnight using compact rocker

 

                                                         Yellow tip

                                                   (probe를 bag에 넣을 수 있는 공간 확보)

                                                       membrane    

                                                         

                                                        bag

 

 

 

  16. Wash with first wash solution. (1x SSPE, 0.1% SDS) at RT for 15 min (two times)

 

   1) Hybridization bag의 모퉁이를 잘라서 solution을 방사선 폐기 통에 버린 후 bag의 한쪽 면        을 완전히 잘라서 membrane을 꺼낸다.

   2) Membrane을 washing통에 넣고 first wash solution을 membrane이 충분히 잠길 정도로

      붓는다.

   3) Compact rocker위에서 speed "6"으로 하여 RT 15min 반응

   4) Solution을 폐기 통에 버리고 한 번 더 반복한다. 이때 틈틈이 radioactivity가 얼마나 되나       측정해본다.

 

 17. Second wash with stringency (0.25x SSC, 0.1% SDS) at 42℃ for 15 min

 

   1) 미리 42℃로 데워둔 second washing solution을 membrane이 잠길 정도로 붓는다.

   2) Compact rocker위에서 speed "6"으로 하여 42℃ incubator에서 15min 반응

   3) Background가 0이 될 때까지 실시한다. 즉, washing solution의 radioactivity가 거의 없을        때까지 실시

   4) Membrane의 radioactivity측정

 

 18. Expose to x-ray film with intensified screen enveloped cassette

    

   1) Cassette를 열고 rap을 한 번 깐다. (가급적이면 주름지지 않게)

      → membrane은 항상 물기가 있어야한다. 즉, cassette에 넣을 때 그 과정 중에서                    membrane이 말라서는 안 된다.

   2) Membrane을 놓는다. (RNA와 probe가 있는 부분이 위로 오도록 하여)

   3) Membrane위에 rap을 한 겹 덮는다.(가급적이면 주름지지 않게)        

   4) 암실로 가서 안전등만 켠 후 X-ray film의 한 쪽 귀퉁이를 짤라 방향성을 표시한 후             cassette에 넣고 빛이 못 들어가도록 cassette를 집게로 짚는다.

   5) -70℃ 보관

     → 반응시간은 membrane의 radioactivity에 따라 결정된다.

     → P32의 경우 radioactivity가 너무 강해서 이 radioactivity를 감소시켜 주기 위해 rap을 깔          아주고 -70℃에서 반응시킨다.

 

 ※ Deprobing: membrane을 재 활용하기 위해서 binding된 probe를 떼어내는 것

   ① deprobing solution

        SDS                 0.5%

        EDTA               5 mM

        SSPE                0.07 X

   ② membrane을 deprobing solution에 넣고 80 oven에서 2hr동안 반응

      → compact rocker로 천천히 흔들어 준다.

   ③ membrane의 radioactivity를 측정 ; background와 같아질때까지 ②를 반복

   ④ UV crosslinking : 앞면 2번, 뒷면 1번

   ⑤ washing : 0.1% DEPC DW

   ⑥ membrane을 3M paper에서 말린 후 재 사용 (until 5 times)

     

    ※ FFM

                10x MOPS running buffer                       5 ml

                37 % formaldehyde                             8.75 ml

                formamide                                      25 ml

                → add 10 ml of formaldehyde loading buffer

                              

 1 mM EDTA, pH 8

 0.25 % bromophenol blue

 0.25 % Xylene Cyanol

 50 % Glycerol

               →   store at -20 ℃

 

 

※ 10x MOPS running buffer

  

  1. Add followings and dissolve

   

       MOPS                                           41.8  g

       S.D.W. treated with DEPC                       800  ml

 

  2. Adjust to pH 7 with NaOH or acetic acid Add

  3. Add followings

    

       3 M DEPC-treated sodium acetate (pH 5.2)       16.7  ml

       0.5 M DEPC-treated EDTA (pH 8)               20.0  ml

 

  4. Bring to 1 liter final vol. with DEPC-treated D.W.

     ☞ MOPS solutions should be stored at room temperature, wrapped in aluminum foil.

        They tend to be yellow with age, but can still be used in this protocol.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

    ※ Northern prehybridization solution : for cDNA/cRNA probe

                   10% SDS                               300㎕

                   20x SSPE                              5  ml

                   100x Denhardts solution                 1  ml

                   Salmon sperm DNA (10mg/ml)          300㎕(★)

                   100 % formamide                       10 ml

                   0.1% DEPC-treated D.W.                3.4 ml

     

                   Final                                    20 ml

   

            ★ : 100℃에서 10분간 확실하게 끓이고 난 후 on ice, 5min

            → store at -20 ℃

 

  ※ Washing Solution

Sol Ⅰ

Sol Ⅱ

  

  20x SSPE       50ml(2x)

  

  20x SSPE        2.5ml(0.1x)

  10% SDS        5ml(0.1%)

  10% SDS         5ml(0.1%)

  D.W            445ml

 

  D.W              492.5ml

 

 at R.T for 10min, 2times

 at 42℃ for 30min, 2times

 

(반드시 10분간 2번을 할 필요는 없다.

그날의 reprobing조건에 따라 시간과 횟수는 조절가능)

(그날의 reprobing조건에 따라 시간과 횟수는 조절가능)

          1. cDNA probe

 

          2. cRNA probe

Sol Ⅰ

Sol Ⅱ

 

 20x SSPE        50ml(2x)

 

 20x SSPE         1.7ml(0.07x)

 10% SDS        5ml(0.1%)

 10% SDS         25ml(0.5%)

 D.W             445ml

 

 D.W              468.3ml

 

at R.T for 10min, 2 times

at 60℃ for 10min, 2 times

 

(반드시 10분간 2번을 할 필요는 없다.

그날의 reprobing조건에 따라 시간과 횟수는 조절가능)

(그날의 reprobing조건에 따라 시간과 횟수는 조절가능)

      ☞ Prehybridization : 42℃(DNA, RNA 상관없음)

      ☞ Hybridization : DNA probe - 42℃, RNA probe - 60℃

      ☞ cDNA probe는 반드시 hybridization전에 heating을 해야함.

         그러나 RNA probe는 절대로 끓이면 안됨